離心機(jī)全血基因組提取DNA的應(yīng)用
離心機(jī)全血基因組提取應(yīng)用
操作步驟(200ul全血)
# 第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇!
1. 取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液,放入1.5ml離心管。
對如果全血起始量小于200μl,則用緩沖液BB補(bǔ)足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之間,則后續(xù)操作需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300μl-1毫升之間,則需要先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解操作(見本說明書后附錄)。
2. 加入200μl 結(jié)合液CB,立刻劇烈顛倒輕搖,充分混勻,再加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液,顛倒輕搖充分混勻,70℃放置10分鐘,溶液應(yīng)變清亮(但顏色偏黑色)。
3. 加入100μl 異丙醇,劇烈顛倒輕搖,充分混勻,此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。
上述各操作步驟中適當(dāng)力度充分混勻非常重要,混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量,必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15秒混勻,但不可用手劇烈振蕩,以免剪切DNA。
4. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)10,000 rpm離心30秒,倒掉收集管中的廢液。
5. 加入500μl抑制物去除液IR,12,000 rpm 離心30秒,棄廢液。
6. 加入700μl漂洗液WB(請先檢查是否已加入無水乙醇!),12,000 rpm 離心30秒,棄掉廢液。
7. 加入500μl漂洗液WB,12,000 rpm 離心30秒,棄掉廢液。
8. 將吸附柱AC放回空收集管中,13,000 rpm離心2分鐘,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
9. 取出吸附柱AC,放入一個干凈的離心管中,在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB(洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱), 室溫放置3-5分鐘,12,000 rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,室溫放置2分鐘,12,000 rpm離心1分鐘。洗脫體積越大,洗脫效率越高,如果需要DNA濃度較高,可以適當(dāng)減少洗脫體積, 但是最小體積不應(yīng)少于50μl,體積過小降低DNA洗脫效率,減少DNA產(chǎn)量。
10. DNA可以存放在2-8℃,如果要長時間存放,可以放置在-20℃。
操作步驟(300ul和 1ml全血)
1. 吸取900μl紅細(xì)胞裂解液(可向本公司購買)到一個1.5ml離心管或者3ml紅細(xì)胞裂解液到一個15ml離心管。
2.將抗凝全血(使用前回復(fù)到室溫)顛倒混勻后,吸取300μl全血和1ml全血分別加到上述1.5ml和15ml離心管中,顛倒6-8次,并倒置輕彈管壁,確保充分混勻。
3.室溫放置10分鐘(期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次幫助裂解紅細(xì)胞)。
4.12,000 rpm離心20秒(對于1.5ml離心管),2,000-3,000 rpm離心5分鐘(對于15ml離心管)倒棄紅色上清,并小心的盡可能多的吸棄上清(注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)),留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約10μl的殘留上清。離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán),也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起,但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán),說明紅細(xì)胞裂解很不充分,應(yīng)該再加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟3,4。
5. 加入200μl緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細(xì)胞團(tuán),充分分散白細(xì)胞團(tuán)。其中由于肝素抗凝血的白細(xì)胞沉淀團(tuán)很難打散重懸,影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)裂解效果,建議選用非肝素的抗凝劑收集血液標(biāo)本。
6. 現(xiàn)在可以按照操作步驟提取DNA了。
操作步驟(10ml全血)
1.吸取30ml紅細(xì)胞裂解液到一個50ml離心管。
2.將抗凝全血(使用前回復(fù)到室溫)顛倒混勻后,吸取10ml加到上述裝有紅細(xì)胞裂解液離心管中,顛倒6-8次,并倒置輕彈管壁,確保充分混勻。
3.室溫放置10分鐘(期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次或者搖床上面輕搖幫助裂解紅細(xì)胞)。
4.2,000 x g離心10分鐘,倒棄紅色上清,并小心的盡可能多的吸棄上清(注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)),留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約100μl的殘留上清。離心后在管底應(yīng)該見到白色的白細(xì)胞團(tuán),也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起,但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán),說明紅細(xì)胞裂解很不充分,應(yīng)該再加入適量紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟3,4。
5. 渦旋振蕩15秒重懸白細(xì)胞團(tuán),充分分散白細(xì)胞團(tuán)。白細(xì)胞的重懸分散對下一步裂解非常重要,白細(xì)胞未打散就加入裂解液,會導(dǎo)致白細(xì)胞不能充分裂解,形成肉眼可見團(tuán)塊。
6. 加入10ml細(xì)胞核裂解液到重懸的白細(xì)胞,迅速有力吹打幾次混勻 以裂解白細(xì)胞,由于基因組DNA立刻釋放出來,這個時候混合物會馬上變得十分粘稠,立刻停止吹打(以免剪切斷基因組DNA),顛倒旋轉(zhuǎn)離心管10次保證裂解液和所有的白細(xì)胞接觸并裂解。這一步對是否獲得滿意的裂解效果和基因組完整性很關(guān)鍵。吹打力量如果太小,不足以迅速將細(xì)胞團(tuán)打散并和裂解液混勻,形成肉眼可見團(tuán)塊無法裂解完全(裂解液如果是和細(xì)胞團(tuán)塊而不是分散的細(xì)胞接觸,立刻會和細(xì)胞團(tuán)塊表面作用后形成粘稠的屏障,不容易再滲透入團(tuán)塊內(nèi)部)。裂解液和細(xì)胞接觸后基因組DNA立刻釋放出來,這個時候吹打力量過大,又易造成基因組斷裂。正確做法,就是迅速有力的吹打幾次,幾秒鐘后基因組釋放出來(變粘稠)立刻停止吹打,或者改用大口徑槍頭(剪去槍頭尖)輕柔吹打或者顛倒混勻。如果還有肉眼可見團(tuán)塊,可在65℃溫育30-60分鐘(不要超過一小時)至裂解完全。
7. 可選步驟:在裂解物中加入RNase A(10mg/ml)至終濃度30μg/ml,顛倒25次混勻,37℃溫育15分鐘去除殘留RNA.然后冷卻回室溫。
8.加入3.33ml蛋白沉淀液后,在渦旋振蕩器上高速連續(xù)振蕩混勻20-25秒?;靹蚝罂赡芤姷揭恍┬〉牡鞍讏F(tuán)塊。由于樣品體積重量小,用渦旋振蕩器振蕩混勻產(chǎn)生的剪切力并不會剪切打斷基因組DNA,如果用手振蕩混勻,則不可以用手上下劇烈振蕩混勻,只能適當(dāng)力度振蕩混勻,否則會剪斷基因組DNA,但是力度也不能小,要保證充分混勻,將粘稠的裂解物打散開,否則DNA無法和蛋白質(zhì)沉淀分離開, 離心的時候會和蛋白質(zhì)一起沉淀下來,造成DNA丟失或者降低產(chǎn)量。此外混勻不充分也可能造成蛋白沉淀不充分, 最后的產(chǎn)物污染有較多量的蛋白質(zhì)。因此建議新手還是用渦旋振蕩器混勻。
9.2,000 x g(可根據(jù)離心效果(沉淀如果不緊)調(diào)整加大離心力)離心10分鐘。這時候應(yīng)該可以見到管底暗褐色的蛋白沉淀,也可能見到一些蛋白沉淀漂浮在液體表面。
10.小心吸取上清(大約10ml)到一個新的15ml離心管中。吸取上清時小心不要吸到管底的和漂浮在液體表面的蛋白沉淀,如果不小心將蛋白沉淀轉(zhuǎn)入新的離心管中,可再次離心2分鐘后取上清。
11.加入等體積的室溫異丙醇(約10ml),輕柔顛倒30次混勻或者直到出現(xiàn)棉絮狀(絲狀)白色DNA沉淀。
注意有時候棉絮狀(絲狀)DNA沉淀顛倒混勻的時候,粘附著在蓋子或者管口處,即使顛倒也不跟下來,或者附著有氣泡導(dǎo)致漂浮在液面,這樣導(dǎo)致操作者看不到沉淀,誤認(rèn)為沒有得到DNA。解決辦法是略去步驟12,直接2,000 x g離心1分鐘,棄上清,然后接步驟14。
12.垂直放置離心管,讓白色DNA沉淀自然沉到管底,然后盡可能多的吸棄大部分的上清,注意不要吸到沉淀。
13.加入10ml70%乙醇后,顛倒混勻,2,000 x g離心1-3分鐘,在管底可以見到白色的DNA沉淀塊,倒棄上清。
14.加入3ml70%乙醇,顛倒幾次漂洗DNA沉淀,2,000 x g離心1分鐘, 倒去上清(沉淀很松,注意不要把DNA沉淀倒掉了),倒置后在吸水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇,還可以用槍頭小心吸掉管底沉淀周圍和管壁的殘留乙醇,空氣晾干沉淀幾分鐘。注意不要干燥過頭,否則DNA極其難溶,也不能殘留太多乙醇,否則乙醇可能抑制下游如酶切反應(yīng)。
15.加入600μlDNA(或者根據(jù)濃度需要調(diào)整用量)溶解液重新水化溶解DNA沉淀,輕彈管壁混勻,可以放置在65℃溫育30-60分鐘(不要超過一小時),也可以在室溫或者4℃放置過夜來重新水化DNA,中間不時的輕彈管壁幫助重新水化DNA。
16. DNA可以存放在2-8℃,如果要長時間存放,可以放置在-20℃。
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